實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)服務(wù)-信帆生物

信帆生物提供RT-PCR實(shí)驗(yàn)代測(cè)服務(wù)，檢測(cè)周期短，實(shí)驗(yàn)操作人員技術(shù)成熟，誤差小，結(jié)果真實(shí)確認(rèn)可靠。

一、服務(wù)介紹

實(shí)時(shí)PCR（real-time PCR），屬于定量PCR（Q-PCR）的一種，以一定時(shí)間內(nèi)DNA的增幅量為基礎(chǔ)進(jìn)行DNA的定量分析。定量方式包括定量和相對(duì)定量。可檢測(cè)mRNA，microRNA，lncRNA和DNA水平的基因拷貝數(shù)變化。

二、服務(wù)流程

1、引物設(shè)計(jì)與合成

2、DNA/RNA抽提

3、反轉(zhuǎn)錄（針對(duì)RNA）

4、上機(jī)定量分析

三、客戶提供

1、全血、組織或細(xì)胞。細(xì)胞：細(xì)胞數(shù)>10⁷，組織：總量>200mg，DNA或RNA樣品：總量>5ug

2、引物，或由信帆生物提供。

3、基因信息：目的基因名稱、物種和序列（或GenBank Accession Number）。

四、交付內(nèi)容

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：詳細(xì)操作步驟

原始數(shù)據(jù)：擴(kuò)增曲線圖，ct值

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)服務(wù)所使用的熒光化學(xué)材料可分為兩大類,即熒光染料和熒光探針。熒光染料以SYBR GreenⅠ為主要代表,是非特異性熒光化學(xué)材料。熒光探針包括TaqMan、分子信標(biāo)、熒光標(biāo)記引物、雜交探針等,屬于特異性熒光材料。

　　SYBR GreenⅠ是一種能夠與雙鏈DNA小溝結(jié)合的染料。在游離狀態(tài)下,SYBR GreenⅠ發(fā)出微弱的熒光,但是一旦與雙鏈DNA結(jié)合,其熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)。因此,一個(gè)反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號(hào)與出現(xiàn)的雙鏈DNA量成正比,可以根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)出PCR體系中的雙鏈DNA的數(shù)量。其優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)方法簡(jiǎn)單,通用性好,價(jià)格相對(duì)較低,是許多實(shí)驗(yàn)室開展熒光定量實(shí)驗(yàn)。SYBR GreenⅠ的缺點(diǎn)在于它能夠和所有的雙鏈DNA相結(jié)合,因此由引物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)、非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物引起的熒光信號(hào)會(huì)影響定量的準(zhǔn)確性。但可以通過優(yōu)化PCR的反應(yīng)條件、選擇設(shè)計(jì)良好的引物,來減少或去除引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生;另外,也可以通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線進(jìn)行分析來判斷熒光信號(hào)的真實(shí)性。

　　TaqMan探針技術(shù)是有美國(guó)Perkin Elmer(PE)公司研制的一種實(shí)時(shí)PCR定量技術(shù),在PCR擴(kuò)增加入一對(duì)引物的同時(shí)加入1個(gè)特異性的熒光探針,此熒光探針為一個(gè)30~45 bp的寡核苷酸,它設(shè)計(jì)為與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對(duì),其5′端標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán),3′端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。當(dāng)探針保持完整時(shí),3′端淬滅基團(tuán)抑制了5′端發(fā)射基團(tuán)的熒光發(fā)射。但在PCR擴(kuò)增中,模板變性后低溫退火,引物與探針同時(shí)與模板結(jié)合,在引物的介導(dǎo)下,沿模板向前延伸至探針結(jié)合處,發(fā)生鏈的置換,Taq DNA聚合酶的5′→3′外切酶活性將探針5′端連接的熒光發(fā)射基團(tuán)從探針上切割下來,游離于反應(yīng)體系中,從而脫離3'端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽,接受光刺激發(fā)出熒光信號(hào)。由于被釋放的熒光基團(tuán)數(shù)目和PCR產(chǎn)物數(shù)量是相對(duì)應(yīng)關(guān)系,且熒光強(qiáng)度同被釋放的熒光基團(tuán)的數(shù)目也是正比關(guān)系,因此該技術(shù)可對(duì)模板進(jìn)行準(zhǔn)確定量。TaqMan探針技術(shù)特異性好、準(zhǔn)確性高、假陽性低、重復(fù)性比較好。但是需要設(shè)計(jì)特異性的探針,因此成本較高。

　　分子信標(biāo)技術(shù)是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)狀雙標(biāo)記寡核苷酸探針,環(huán)部與靶DNA序列互補(bǔ),為15~35 bp;莖部是由互相配對(duì)的堿基組成,但與靶DNA無序列同源性,約8 bp。在探針的5′端和3′端分別標(biāo)記熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。當(dāng)溶液中的模板與分子信標(biāo)結(jié)合配對(duì)時(shí),分子信標(biāo)的構(gòu)象改變成鏈狀使得熒光發(fā)射基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分開,當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時(shí),就發(fā)出熒光信號(hào)。與探針互補(bǔ)的靶分子數(shù)量越多,熒光信號(hào)也就越強(qiáng),從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)目的基因的定量檢測(cè)。分子信標(biāo)的方法優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng),熒光背景低。其缺點(diǎn)是設(shè)計(jì)困難,雜交探針不能*與模板結(jié)合,穩(wěn)定性較差,價(jià)格高。

【儀器設(shè)備】 
PCR擴(kuò)增儀 
電泳裝置 
微量離心機(jī) 
微量移液器（1～20ml和20～200ml） 
0.5ml Eppendorf 管 
紫外線觀察裝置及照相設(shè)備
2.2.2.3 操作程序 
1．在無菌的Eppendorf管內(nèi)加入以下反應(yīng)物：

2．93℃ 反應(yīng)2 min后開始以下循環(huán)： 
93℃變性反應(yīng)1 min； 
50℃退火反應(yīng)1 min； 
72℃延伸反應(yīng)3 min。 
經(jīng)過17～35循環(huán)后，zui后一個(gè)循環(huán)72℃增加5 min。循環(huán)結(jié)束后反應(yīng)產(chǎn)物置于40℃保存。 
3．取1～5ml反應(yīng)產(chǎn)物走凝膠電泳，經(jīng)溴化乙錠染色檢測(cè)擴(kuò)增的情況。

2.2.2.4 應(yīng)注意的問題及其解決方法 
1．PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 
要優(yōu)化特定的PCR反應(yīng)，有必要試用不同的反應(yīng)組分和循環(huán)參數(shù)。表2-1列出了添加或改變某一試劑濃度對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響，從中大家可以得到一些線索以改進(jìn)反應(yīng)條件，提高PCR產(chǎn)量和/或特異性，一般情況下，只須改變一兩個(gè)參數(shù)就行了，如pH值和MgCl₂濃度。表2-2給出了循環(huán)參數(shù)對(duì)PCR結(jié)果的影響。 
表2-1 PCR各反應(yīng)組分濃度對(duì)產(chǎn)物特異性和產(chǎn)量的影響

* 效果可能不可預(yù)測(cè)
** 添加10% DMSO時(shí)，Taq DNA聚合酶的活性會(huì)被抑制47%，因此反應(yīng)加大Taq DNA聚合酶的用量（即5U）予以補(bǔ)償
*** Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut
表2-2 可改變以提高PCR產(chǎn)物的特異性和/或產(chǎn)量的循環(huán)參數(shù)

* 使用基因組DNA作模板時(shí)，開始幾個(gè)循環(huán)變性應(yīng)于97℃進(jìn)行 
** 假定Tm值為60℃ 
*** 延伸時(shí)間依產(chǎn)物大小而定：1000bp的產(chǎn)物延伸30s即可，產(chǎn)物更長(zhǎng)時(shí)，按每1000 bp延伸0.5 min計(jì)，在后期循環(huán)中增加延伸時(shí)間可以提高擴(kuò)增效率
2．引物的設(shè)計(jì) 
毫無疑問，引物的堿基組成，長(zhǎng)度及其靶序列的同源性是決定PCR成敗的首要因素，選擇設(shè)計(jì)引物在一定程度上仍然要靠經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于某一對(duì)引物而言尚無通用的規(guī)則可嚴(yán)，但應(yīng)遵守以下原則： 
（1）一般性原則： 
①長(zhǎng)度：15～30bp，其有效長(zhǎng)度 [Ln=2 (G+C)+(A+T)] 一般不大于38，否則PCR的zui適延伸溫度會(huì)超過Taq酶的*作用溫度（74℃），從而降低產(chǎn)物的特異性。 
②G＋C含量：應(yīng)在45%～55%之間，PCR擴(kuò)增中的復(fù)性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去5～10度。引物長(zhǎng)度小于20時(shí)，其Tm值等于4×(G+C)+2×(A+T)。 
③ 堿基分布的隨機(jī)性：應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個(gè)以上的單一堿基。尤其是不應(yīng)在其3’端出現(xiàn)3個(gè)的連續(xù)的G或C，否則會(huì)使引物在G＋C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。 
④ 引物自身：不能含有自身互補(bǔ)序列，否則會(huì)形成發(fā)夾樣二級(jí)結(jié)構(gòu)。 
⑤引物之間：兩個(gè)引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)的互補(bǔ)或同源堿基，不然會(huì)形成引物二聚體，尤應(yīng)避免3’端的互補(bǔ)重疊。 
⑥特異性：與非特異擴(kuò)增序列的同源性應(yīng)小于70%，或少于連續(xù)8個(gè)的互補(bǔ)堿基。 

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