豬瘟病毒抗原檢測試劑盒說明書

Classical Swine Fever Virus Antigen Test Kit (CSFV Ag)

用途

HerdChek 豬瘟病毒抗原檢測試劑盒/血清,是根據酶聯免疫反應原理設計的、用于檢測血清、血漿中豬瘟病毒抗原的一種診斷試劑盒。

概述

牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）, 邊界病毒（Border Disease Virus BDV）和豬瘟病毒（CSFV）是同屬于黃病毒科瘟病毒屬的3 個成員。豬瘟由于其高度的病原性和廣泛的致死性，對養豬業造成嚴重的損失。感染高致病力豬瘟病毒后，豬在出現癥狀前會排出大量的病毒。耐過急性或亞急性的感染的動物會產生抗體并且不再散毒。低致病力溫和病毒會造成豬的慢性的感染，病豬將會持續或間歇排出病毒直至死亡。

懷孕母豬與豬瘟病毒接觸后可能通過胎盤感染胎兒。先天性的感染可能導致流chan，木乃伊胎兒，死產和/或弱仔及畸形胎兒。豬也有可能感染BVDV 或BDV，盡管這些感染通常呈溫和經過并且是自限性的,而且很難檢測到病毒。HerdChek CSFV 抗原檢測試劑盒對瘟病毒屬病毒有*的敏感性，不能區分BVDV 或BDV 抗原，陽性檢測結果需要用CSFV 特異的方法確認。

此試劑盒只用于獸醫體外診斷。

原理

HerdChek 豬瘟病毒抗原/血清是為檢測血清和血漿樣品中的豬瘟病毒抗原(Ag)設計的酶聯免疫吸附試驗。這個微量滴定的形式是將豬瘟病毒(Erns)的單克隆抗體包被于微量板上裝配而成的。樣品中的豬瘟病毒抗原被捕獲在板子上。在將檢測樣品于微孔中孵育之后，捕獲的豬瘟病毒抗原由瘟病毒特異性抗體和辣根過氧化物酶標記物來檢測。然后，沒結合的酶標記物被洗掉，再加入底物和/色原體溶液。在酶的存在下，底物轉化為可以與色原體發生反應的產物并產生藍色。在加了終止液之后，產生黃色。用分光光度儀檢測在450 nm [A(450)]下的單波長或者450 nm 和 650 nm [A(450/650)]雙波長下的吸光值。樣品的校正OD 值由檢測樣品得到的吸光值和陰性對照的校正吸光值來計算

試劑

   所有試劑要保存在2－8℃。

   1. Ems 單克隆抗體包被的微量反應板 2 板 5 板

   2. 陽性對照1.6 ml 2 ml

   3. 陰性對照1.6 ml 2 ml

   4. 辣根過氧化物酶標記物25 ml 60 ml

   5. 檢測抗體 15 ml 30 ml

      A. 10 倍濃縮洗滌液125 ml 480 ml

      B. TMB 底物溶液20 ml 60 ml

      C. 終止液20 ml 60 ml

自備器材

    ·的吸管或微量移液器，用來吸取10～1000微升(μl)的液體。

    ·微量移液器使用的吸頭。

    ·用來稀釋洗滌液的500ml量筒。

    ·適用96孔微量反應板的酶標儀。

    ·蒸餾水或去離子水。

    ·滴加和吸去洗滌液的設備

    ·可以盛裝液體和消毒液的容器

    ·溫箱或封板器

    ·振蕩器

注意事項

   ·把它當作潛在的傳染源來處理所有的生物材料。

   ·禁用嘴吸液。

   ·處理樣品和試劑盒的地方禁止飲食和吸煙。

   ·底物溶液對眼睛、皮膚以及呼吸系統都有刺激作用，在使用過程中要防止該溶液接觸眼睛和皮膚。

   ·終止液中含有1M HCl,容易引發燒傷。要小心處理。

   ·避免底物TMB照到強光，或接觸到氧化劑。盛裝TMB溶液的容器要用干凈的玻璃或塑料器皿。

   ·所有試劑一律放置2-8℃ 保存。所有試劑用前恢復至室溫18-25℃，用完后返回到2-8℃以便下次使用。

   ·用過的材料要無害化處理。

   ·使用處理各個試劑時要小心操作，嚴防對試劑的污染。

   ·不要使用過期的試劑盒；禁止非同批試劑盒混用。

   ·嚴格按照操作程序，仔細地吸液、計時、充分洗滌，對于獲得和準確的結果是非常必要的。

   ·每次檢測均要加做2個陰、陽性對照。

   ·在檢測中，試劑的準備應用雙蒸水或去離子水配制。

   ·沒有用完的微量反應板應貯存在密封塑料袋內，于2-8℃存放。

   ·僅供獸醫。

試劑準備

洗滌液制備

10 倍濃縮的洗滌液在使用前必須讓它恢復到室溫，使用時要搖勻使析出的鹽溶解，并用蒸餾水或去離子水進行10 倍稀釋（如:30ml 的濃縮洗滌液要加270ml 的水并充分混勻）。無菌條件下制備的洗滌液在2-8℃可保存1 周。

樣品準備

   血清和血漿(新鮮或凍結)都可用于檢測。

操作步驟

   在使用之前，所有的試劑盒組分都必須恢復到室溫（18－25℃）。試劑應通過輕輕渦旋、旋轉混合均勻。

每個樣本都使用不同的吸頭。

   1. 取出用抗體包被的微量反應板，并在紀錄表上標記好每個樣本的位置。

   2. 在每個反應孔中加入50μl 的檢測抗體。可以用移液器（8 或12 道）加樣。

   3. 在陰性對照的雙孔中各加50μl 陰性對照。

   4. 在陽性對照的雙孔中各加50μl 陽性對照。

   5. 在剩下的反應孔中分別加入50μl 被檢樣品。對于不同的被檢樣品要更換吸頭。

   6. 輕彈微量反應板或用振蕩器振蕩，將反應板中的溶液混勻。

   7. 在37℃的條件下孵育2 小時，也可在2－8℃的條件下孵育過夜（12-18 小時于冰箱中）。在孵育過程中應將微量反應板封閉或在濕盒內孵育，以防反應孔中的液體蒸發。

   8. 吸出反應孔中的液體物質并棄入廢液缸中。

   9. 每個反應孔加入約300μl 的洗滌液進行洗滌，洗滌五次。每次洗滌后吸出所有孔中的液體。在洗滌時以及在加辣根過氧化物酶標記物之前要防止反應板出現干燥現象。在zui后一次洗滌完后，將反應板在吸水

性強的物質上拍干。

   10. 在每個反應孔中加入100μl 辣根過氧化物酶標記物。

   11. 在室溫下（18－25℃）孵育30 分鐘。

   12. 重復步驟8 和9。

   13. 在每個反應孔中加入100μlTMB 底物。

   14. 在室溫（18－25℃）條件下于黑暗處孵育10 分鐘。在加完*個孔后開始計時。

   15. 在每個反應孔中加入100μl 的終止液終止反應。在加終止液時要按第13 步的順序進行滴加。

   16. 將酶標儀在空氣中調零。

   17. 于450nm 單波長或450nm 和650nm 雙波測定樣本以及對照的吸光值。

   18. 計算結果。

結果

   陽性對照OD 的平均值（PCx）與陰性對照OD 的平均值（NCx）之差（P-N）必須大于或等于0.150OD，另外陰性對照OD 的平均值（NCx）必須小于或等于0.250 OD，這樣實驗結果才算成立。

   若試驗結果失敗，有可能是實驗操作失誤造成，應按操作說明進行重復試驗。

   判斷各樣品是否含有待測抗原主要通過計算修正OD 值（S-N）來決定的。