堿性磷酸酶染液(鈣鈷法)

( Cell alkaline phosphatase staincAkP)

檢驗原理

CAKP 在 pH值 9.4 的環(huán)境下，以鎂離子作為激活劑，能夠把B-甘-油磷酸鈉水解出磷酸，磷酸與高濃度的鈣鹽結(jié)合形成無色的磷酸鈣，再與硝酸鉆作用形成磷酸鉆，經(jīng)硫化胺處理形成黑色的硫化鉆沉淀在酶活性處。

基質(zhì)液的配制:試劑二基質(zhì)液 A: 試劑三基質(zhì)液 B=20:1，混勻后待用，用多少配多少，滴染法每片只需基質(zhì)液 A200，基質(zhì)液 B10l，配好的基質(zhì)液應(yīng)為無色透明液體，盡快使用。試劑五的保存:試劑五需-20℃保存，必須在收到試劑后立即根據(jù)實驗需要分裝凍存，以避免反復(fù)凍融而導(dǎo)致試劑失效。

儲存條件及有效期

本試劑盒中試劑五需置-20℃保存，其余試劑應(yīng)置 2℃~8℃密封保存，有效期 6個月。

樣本前處理

石蠟切片脫蠟及再水合:

1. 脫蠟:將石蠟切片放入 37℃~60℃的保溫箱中 10 分鐘左右，再放入二甲苯或無毒環(huán)保脫蠟劑 10 分鐘，再放入二甲苯或無毒環(huán)保脫蠟劑 5 分鐘。(本所有無毒環(huán)保脫蠟劑供應(yīng)，可代替二甲苯，若使用本所無毒環(huán)保脫蠟劑，脫蠟時間調(diào)整為15 分鐘X2 次)；

2. 水合:將已脫蠟的切片放入 95%乙醇2分鐘-75%乙醇 2分鐘-30%乙醇 2分鐘一蒸餾水洗 2 分鐘X3 次:

染色步驟

可用滴染法也可選用染缸法，樣本量少可用滴染法，樣本多可用染缸法

一、固定及水潤

1.新鮮血涂片、骨髓涂片、細胞涂片或爬片、用試劑一進行固定約 2~5 分鐘，自然晾干。待染(冰凍切片及石蠟切片按常規(guī)處理，不需要固定)；

2.水潤: 固定后的樣本及已脫蠟并水合的組織切片，請在染色前將樣本切片用蒸餾水潤洗30 秒，以保持濕潤；

二、滴染法

1.滴加基質(zhì)液數(shù)滴，覆蓋已處理好的樣本上， 37℃避光孵育 15 分鐘左右，甩掉多余的染液，不要水洗；

2.立即滴加試劑四染液染色 5 分鐘，水洗 30 秒，甩去多余的水，但要保持樣本濕潤；

3.再滴加試劑五染色 30 秒左右，水洗 30 秒，甩去多余的水，但要保持樣本濕潤；

4.滴加試劑六復(fù)染 30 秒，水洗 30 秒，甩干，鏡檢；

三、染缸法

1.將將玻片放入基質(zhì)液染缸中，37℃避光孵育 15 分鐘，不要水洗

2.將玻片轉(zhuǎn)移至試劑四染液染缸中染色 5 分鐘，水洗 30 秒，甩去多余的水，但要保持樣本濕潤；

3.再放入試劑五染液染缸中染色 30~60 秒左右，水洗 30 秒，甩去多余的水，但要保持樣本濕潤；

4.再放入試劑六染缸中染色 30 秒，水洗 30 秒，甩干，鏡檢；

染色結(jié)果

胞質(zhì)中陽性反應(yīng)呈現(xiàn)灰黑色顆粒或塊狀、條狀沉淀。

堿性磷酸酶染液(鈣鈷法)