NADPH-細(xì)胞-色素c還原酶(NCR)試劑盒

（貨號(hào)：A132-1-1 NADPH-Cytochrome-c Reductase， 分光光度法 50T/48樣）

一、測(cè)定意義：

細(xì)胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶,在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用,尤其是藥物和毒物的代

謝。NCR作為P450酶系的重要一員，催化氧化型P450還原再生。

二、測(cè)定原理：

NCR催化NADPH還原氧化型細(xì)胞-色素c，還原型細(xì)胞-色素c在550nm處有獨(dú)-特吸收峰；通過測(cè)定550nm吸光度的增

加速率，來計(jì)算NCR活性。

三、需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、普通離心機(jī)、超速離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿和蒸餾水

四、試劑的組成和配制：

試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前加入100mL 蒸餾水充分溶解。

試劑二：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入2.60mL 蒸餾水充分溶解，4℃保存。

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入550μL 蒸餾水充分溶解，4℃保存。

五、粗酶液提取：

① 稱取約0.5g組織，加入4℃預(yù)冷的1mL試劑一，冰上充分研磨，10,000g，4℃離心30min，取上清液轉(zhuǎn)移到超速

離心管中；

② 在4℃，100,000g離心60min，棄上清液；

③ 在沉淀中加入1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100,000g離心30min，棄上清液；

④ 向上步驟沉淀中加入0.5mL試劑二，蓋緊后充分震蕩溶解，4℃保存待測(cè)。

六、測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至550nm，蒸餾水調(diào)零；

2、 試劑二在37℃水浴預(yù)熱30min以上；

3、 樣本測(cè)定

（1）空白管：取1mL玻璃比色皿，一次加入50μL蒸餾水、900μL試劑二、50μL試劑三和10μL試劑四，迅速

混勻后于550nm處分別測(cè)定第10s吸光值A(chǔ)1和第130s吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA空白=A2-A1。（每批樣本只需做一個(gè)空白管）

（2）測(cè)定管：取1mL玻璃比色皿，一次加入50μL粗酶液、900μL試劑二、50μL試劑三和10μL試劑四，迅速

混勻后于550nm處分別測(cè)定第10s吸光值A(chǔ)3和第130s吸光值A(chǔ)4；計(jì)算ΔA測(cè)定=A4-A3。

七、NCR 活力單位的計(jì)算

1、按照蛋白濃度的計(jì)算:

單位定義：37℃反應(yīng)條件下，每mg蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細(xì)胞-色素c定義為1U；

NCR（U/mg prot）＝（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷(ε×d)×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

＝ 529×（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷ Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算:

單位定義：37℃反應(yīng)條件下，每g樣品每分鐘催化產(chǎn)生1nmol還原型細(xì)胞-色素c定義為1U；

NCR（U/g）＝（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷(ε×d)×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T

＝ 265×（ΔA測(cè)定-ΔA空白）÷W

ε：還原型細(xì)胞色素c在550nm處摩爾吸光系數(shù)為1.91×10 4L/mol/cm=0.0191 L/μmol/cm；

d：比色皿光徑（cm），1cm；

V反總：反應(yīng)體系總體（L），1010μL=1.01×10 -3L；

Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；

V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），50μL=0.05mL；

V樣總：加入提取液體積（mL），0.5mL；

T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），2min；

W：樣本質(zhì)量，（g）。

 NADPH-細(xì)胞-色素c還原酶(NCR)試劑盒